m13引物-m13引物退火温度

摘要： 本文目录一览：1、...T载体克隆,使用M13通用引物,扩增片段长度是多少?2、...

本文目录一览：

• 1、...T载体克隆,使用M13通用引物,扩增片段长度是多少?
• 2、连接转化成功后,用m13的引物做pcr,跑出好几条带是怎么回事
• 3、做克隆后挑菌,用M13引物扩增菌液呈阳性,特异性引物扩增同一菌液则阴性...
• 4、用m13引物pcr扩增克隆载体,产生多个条带,能够测序吗
• 5、用m13通用引物扩增blunt载体得到多条pcr产物,怎么办
• 6、求助通用引物验证阳性克隆

...T载体克隆,使用M13通用引物,扩增片段长度是多少?

1、这个问题是这个样子的：首先你要有pGEM-T载体跟你片段的序列，把他们粘贴***到word文档里。其次，在文档里把你的片段序列编辑到载体序列中，位置要跟片段实际在质粒中插入的位置相同。

2、遵循原则如下： 引物长度：引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25-35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。

3、一般情况下用T载体上通用M13引物，选择双向测序可以达到测通的效果。但是对应的两个末端的结果不太可靠，所以需要人为的选择、拼接一下，当然一些测序公司会根据测序的情况自动给你拼接好。

连接转化成功后,用m13的引物做pcr,跑出好几条带是怎么回事

如果是目的条带有两条，那么可能是引物出现了错配，也有可能是本身就有两种可能。回收测序即可。

非特异扩增呗，引物特异性不够高，退火温度过低。

改善PCR反应条件，从你提供的情况看，55度退火太低。建议做个温度梯度PCR，在55度到67度间，每升高2度，做一个反应。另建议将反应体系设为20微升（温度升降过程易于达到目标值）。

可能是PCR反应条件不是最佳。退火温度比较低会造成非特异条带的扩增。

如果在鉴定转基因小鼠ai14的PCR反应中跑出了三条带，可能有以下原因：误差或污染：可能在试剂、处理样本、反应器等方面产生了误差或者污染，导致PCR反应中形成了不同大小的杂交产物。

做克隆后挑菌,用M13引物扩增菌液呈阳性,特异性引物扩增同一菌液则阴性...

建议检测克隆的退火温度提高至60-62度，挑取菌体尽量不要沾上培养基尽量少。

如果你用了插入片断特异的引物扩增，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），因此很可能出现阳性。

通用引物，含义为克隆位点两旁的序列匹配，目的是引扩出DN段，主要用来测序。而序列特异性引物指一种测定基因突变的方法。通用引物是一般和载体多克隆位点两旁的序列匹配，或者是与载体里面的一些启动、终止元件匹配。

两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer(PCR时的下游引物)作为反转录引物。

这个我也遇到过，可能你的菌液PCR是阳性。

用m13引物pcr扩增克隆载体,产生多个条带,能够测序吗

如果是目的条带有两条，那么可能是引物出现了错配，也有可能是本身就有两种可能。回收测序即可。

这种现象我也出现过，我分析的可能是因为M13引物自身的特性，如果P长片段，很可能会非特异的与质粒基因组DNA结合或者与质粒结合而产生长度在2000bp左右的条带，会很难验证克隆是否成功。

可以。克隆基因最后这几步你是指什么？你将基因连到T载体上，测序验证对了，就行了。接下来构建载体什么的，直接可以用T载体上序列做模版了。

用m13通用引物扩增blunt载体得到多条pcr产物,怎么办

1、所以，建议用目的片段的特异引物进行PCR反应，或者直接送测序。

2、有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

3、最好在引物设计时考虑增加酶切位点以及添加序列标签等。如果是扩增未知序列基因，一般要根据序列比对找到保守序列，设计兼并引物，扩增产物一般是目的基因的部分序列，还要通过5‘race以及染色体步移等操作得到全长序列。

4、一般这种情况下是调高退火温度。如果还是有很多条带，那么就证明你的引物特异性有问题，建议你重新设计引物，或者是切胶回收目的条带。

求助通用引物验证阳性克隆

1、M13R；M13F(-47)，M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。

2、菌落PCR。设计引物扩增质粒特有的目的片段，如果阳性克隆里面有改片段，则说明转化成功。2 快抽质粒。将阳性菌落划平板，几个小时后，富集菌，然后快速抽提。看质粒大小有没有插入目的片段。3 提质粒，酶切鉴定。

3、质粒载体pBR322具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记。

4、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。